Αντικείμενο και στόχοι του έργου.

Η έκθεση των κυττάρων και των ιστών σε μειωμένες συγκεντρώσεις οξυγόνου, κατάσταση γνωστή ως υποξία, παρατηρείται τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις όπως η φλεγμονή και ο καρκίνος. Όλα τα εμπύρηνα κύτταρα στον ανθρώπινο οργανισμό έχουν την ικανότητα να αντιλαμβάνονται αλλαγές στα επίπεδα οξυγόνου στο περιβάλλον τους και έχουν αναπτύξει μηχανισμούς ώστε να αποκρίνονται κατάλληλα στην υποξία. Οι κύριοι ρυθμιστές της κυτταρικής απόκρισης στην υποξία είναι μια ομάδα μεταγραφικών παραγόντων που είναι γνωστοί ως επαγόμενοι από την υποξία παράγοντες HIF (Hypoxia Inducible Factors). Οι HIFs είναι πρωτεΐνες που προσδένονται στο DNA και λειτουργούν ως ετεροδιμερή αποτελούμενα από μία οξυγόνο-ρυθμιζόμενη άλφα υπομονάδα και μία σταθερή βήτα υπομονάδα. Η υπομονάδα HIFα υπόκειται σε οξυγονο-εξαρτώμενη ρύθμιση. Παρουσία φυσιολογικών επιπέδων οξυγόνου, η πρωτεΐνη αυτή συντίθεται και αποικοδομείται συνεχώς από το πρωτεάσωμα. Όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε περιβάλλον υποξίας, η HIFα υπομονάδα σταθεροποιείται, συσσωρεύεται στον πυρήνα όπου ετεροδιμερίζεται με την HIFβ υπομονάδα και το ετεροδιμερές προσδένεται στο DNA. Οι HIF ενορχηστρώνουν μια συντονισμένη απόκριση που βασίζεται σε αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση με σκοπό την προσαρμογή και επιβίωση των κυττάρων στην υποξία.

Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των HIF και άλλων πρωτεϊνών του μονοπατιού απόκρισης στην υποξία αποτελούν έναν ευρέος χρησιμοποιούμενο μηχανισμό ρύθμισης και ενεργοποίησης της απόκρισης στην υποξία. Η σουμοϋλίωση είναι μία αντιστρεπτή μετά-μεταφραστική τροποποίηση η οποία χαρακτηρίζεται από την ομοιοπολική σύνδεση των μικρών πρωτεϊνών SUMO (small ubiquitin-like modifier) σε άλλες πρωτεΐνες-υποστρώματα. Η σύζευξη των SUMO πρωτεϊνών με τις πρωτεΐνες στόχους επιτυγχάνεται μέσω SUMO-ειδικών ενζύμων τα οποία χρησιμοποιώντας ενέργεια από την υδρόλυση της τριφωσφορικής αδενοσίνης (ΑΤP) δρουν με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της ουβικιτινίωσης. Τα στάδια του μηχανισμού σύζευξης παρουσιάζονται στην παρακάτω εικόνα:

Η σουμοϋλίωση θεωρείται ότι παίζει ρυθμιστικό ρόλο στην απόκριση των κυττάρων σε ενδογενή και εξωτερικά ερεθίσματα. Παρά την μεγάλη σημασία της σουμοϋλίωσης στην φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων και κατά συνέπεια των οργανισμών, τα τελευταία χρόνια η τροποποίηση αυτή συσχετίζεται όλο και περισσότερο και με παθολογικές καταστάσεις όπως το οξειδωτικό στρες, το θερμικό σοκ και την ισχαιμία. Πιο συγκεκριμένα, στην υποξία, παρατηρούνται αλλαγές είτε στο γενικό πρότυπο της σουμοϋλίωσης είτε στα επίπεδα σουμοϋλίωσης συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Καθώς τόσο η υποξία, όσο και η σουμοϋλίωση πρωτεϊνών σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις η εύρεση νέων σημείων παρέμβασης και η κατανόηση νέων αλληλεπιδράσεων θα μπορούσε να έχει μελλοντική θεραπευτική αξία.

Χρησιμοποιώντας μια πρόσφατα καθιερωμένη μέθοδο ανοσοκατακρήμνισης των ενδογενών σουμοϋλιωμένων πρωτεϊνών σε συνδυασμό με ποσοτική φασματομετρία μάζας σε κύτταρα HeLa εντοπίστηκε ένας αριθμός πρωτεϊνών όπως ο μεταγραφικός παράγοντας TFAP2A των οποίων το πρότυπο σουμοϋλίωσης μεταβάλλεται σημαντικά στην υποξία χωρίς να επηρεάζεται η έκφρασή τους σε πρωτεϊνικό επίπεδο. H παρούσα έρευνα έχει στόχο τη μελέτη της σουμοϋλίωσης ως ρυθμιστικό μηχανισμό καθώς επίσης και τη διερεύνηση της εμπλοκής νέων παραγόντων στην κυτταρική απόκριση στην υποξία.

Οι επιμέρους στόχοι της έρευνας είναι οι ακόλουθοι:

Στόχος 1. H διερεύνηση του ρόλου του TFAP2A και της σουμοϋλίωσης του στην υποξία όσον αφορά τις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, τη δέσμευση σε υποκινητές γονιδίων που επάγονται στην υποξία καθώς και την προσαρμογή και απόκριση των κυττάρων.

Στόχος 2. Ο χαρακτηρισμός του μηχανισμού σουμοϋλίωσης πρωτεϊνών που ανιχνεύθηκαν στην SILAC-IP ανάλυση καθώς και η διερεύνηση της βιολογικής τους σημασίας στην κυτταρική απόκριση στην υποξία.

Πρωτοτυπία του Ερευνητικού έργου

Στον παρόν ερευνητικό έργο:

• Χαρακτηρίζεται για πρώτη φορά η επίδραση της σουμοϋλίωσης στη λειτουργία πρωτεϊνών όπως μεταγραφικοί παράγοντες, συμπαράγοντες μεταγραφής, ένζυμα επεξεργασίας RNA.
• Διερευνάται για πρώτη φορά η εμπλοκή πρωτεϊνών, με αδιευκρίνιστους μέχρι στιγμής ρόλους, στο μηχανισμό προετοιμασίας των καρκινικών κυττάρων για την προσαρμογή και την επιβίωση τους σε χαμηλές συνθήκες οξυγόνου.
• Μελετάται εκτενώς η αλληλεπίδραση νέων πρωτεϊνών με τους βασικούς μεταγραφικούς παράγοντες της υποξίας HIF με στόχο την αποκάλυψη νέων σημείων ρύθμισης στον οξυγονοεξαρτώμενο μηχανισμό επαγωγής γονιδίων στόχων της υποξίας.

Με την ανακάλυψη νέων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων αλλά και την εύρεση νέων πιθανών σημείων ελέγχου και διασταύρωσης μεταξύ της σουμουλίωσης και των μεταγραφικών παραγόντων της υποξίας (HIF), όπου στοχεύουμε μέσα από το ερευνητικό έργο θα συμβάλλουμε στην αποκάλυψη άγνωστων πτυχών του μονοπατιού προσαρμογής του κυττάρου στην χαμηλή διαθεσιμότητα οξυγόνου. Η γνώση και περαιτέρω μελέτη των νέων αυτών σημείων ελέγχου του κυτταρικού μηχανισμού ανταπόκρισης στην υποξία θα μπορούσε μελλοντικά να ανοίξει τον δρόμο για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παρεμβάσεων.